Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Phylogenetic Inference by Maximum Parsimony Method (In Depth)

Sekedar menyelesaikan sharing-sharing ria bersama mengenai proses inferensi filogenetik, kali ini saia mencoba membawakan satu lagi konsep yang melatarbelakangi algoritme Maximum Parsimony (MP). Yah sekian saja deh kata sambutan dari saia dan selamat membaca ^^/

A. Pengantar
Konsep parsimony dapat dikatakan merupakan konsep pertama yang mengawali analisis kekerabatan antar organisme. Konsep ini dikemukakan oleh Willi Henning, seorang entomolog Jerman, yang berpendapat bahwa hubungan kekerabatan antar organisme hanya dapat ditarik dari kemiripan/similaritas yang diturunkan dari nenek moyangnya. Hal ini tentu saja berbeda dengan pandangan fenetik pada saat itu yang menganggap kemiripan secara keseluruhan (overall similarity) harus dikaitkan semuanya dalam mengevaluasi suatu kekerabatan diantara organisme. Kemiripan karakter yang diturunkan dari nenek moyang tersebut diistilahkan sebagai "symplesiomorphy", sementara kemiripan yang didapatkan dari proses adaptasi diistilahkan sebagai "synapomorphy". Kedua kata tersebut secara berturut-turut diturunkan dari kata "plesiomorph" yang berarti karakter nenek moyang (ancient) dan "apomorph" yang berarti karakter yang didapatkan (derived).

Konsep parsimony berlaku hingga kini dan juga telah diterapkan untuk sequence molekular. Intinya adalah mencari pohon filogenetik yang memerlukan asumsi paling sedikit dalam menghubungakan semua organisme/taksa yang dikaji. Asumsi yang dimaksud dalam hal ini adalah proses substitusi nukleotida. Konsep yang sama juga berlaku ketika menggunakan sequence asam amino. Substitusi yang semakin sedikit juga berarti meminimalisir panjang branch length, sehingga pohon Maximum Parsimony (MP) adalah pohon yang dapat menghasilkan tree length (total branch length) minimum.

B. Situs Informatif (Parsimony Informative Sites)
Dalam algoritme Maximum Parsimony tidak semua situs dalam sequence menyediakan informasi mengenai jejak-jejak plesiomorph molekular. Gambar 1 dapat membantu menjelaskan perbedaan antara situs informatif, variabel, singleton (situs dimana hanya ada 1 taksa yang berbeda), dan invariabel. Situs variabel merupakan situs yang mengandung keempat jenis nukleotida (A, T, G, dan C). Situs ini tidak informatif karena tidak ada pohon parsimonius yang lebih mampu menjelaskan substitusi mana yang lebih sedikit dibandingkan yang lain. Situs singleton dan juga situs invariabel juga sama-sama tidak dapat memberikan informasi mengenai pohon mana yang bersifat parsimonius.

Gambar 1. Perbandingan antara situs informatif, variabel, singleton, dan invariabel.

Dengan demikian, syarat sebuh situs agar bersifat informatif adalah situs tersebut harus memungkinkan adanya perbedaan perhitungan jumlah substitusi antar topologi untuk menjelaskan variasi yang terdapat pada situs tersebut. Hal ini berarti bahwa sebuah situs informatif setidaknya harus memiliki dua jenis nukleotida dan keduanya harus muncul setidaknya dua kali pada situs tersebut. Gambar 1 memperlihatkan bahwa sebuah situs untuk 4 taksa yang mengandung A, A, G, G merupakan situs informatif. Hal ini dapat terlihat dari 3 jenis kandidat pohon yang dibuat bahwa pohon 1 merupakan pohon yang paling parsimonius (mengandung substitusi paling sedikit).

C. Tahap Rekonstruksi Pohon MP
Kita akan mencoba merekonstruksi pohon MP untuk 4 taksa terlebih dahulu. Jika diberikan 4 taksa dengan sequence alignment n, maka algoritme MP hanya akan menggunakan situs-situs informatif dari n-situs tersebut untuk rekonstruksi pohonnya. Nah tahapannya dapat saia simpulkan seperti ini:

1. Tentukan kemungkinan pohon yang dapat direkonstruksi dari sejumlah taksa yang diuji. Dalam contoh kali ini ada 4 taksa, sehingga terdapat 3 kandidat pohon.
2. Tentukan kombinasi nukleotida untuk penentuan character state pada nodus internal. Jumlah nodus internal untuk pohon dengan n-taksa adalah n-2. Dalam contoh kasus 4 taksa kita, maka ada 2 nodus internal. Nah karena ada 4 jenis nukleotida yang mungkin menempati nodus internal tersebut, maka kombinasi total kemungkinan nukleotida dirumuskan dengan 4^i dengan i sebagai jumlah nodus internal. Dengan demikian akan ada 16 kombinasi nukleotida pada nodus internal untuk kasus 4 taksa kita (Gambar 2). Kemudian dari 16 kombinasi tersebut, tentukan kombinasi nukleotida nodus internal dengan jumlah substitusi paling sedikit (Gambar 2, kotak).

Gambar 2. Kombinasi jenis nukleotida untuk dua nodus internal pada kasus filogeni 4 taksa.

3. Dengan menggunakan SETIAP situs informatif yang tersedia, tentukan pohon yang memberikan jumlah total substitusi paling sedikit.

Nah pohon dari seluruh kandidat pohon yang memberikan jumlah substitusi paling sedikit merupakan pohon terbaik menurut algoritme MP atau dapat disebut juga sebagai pohon MP. Dari tulisan sebelumnya kita mengetahui bahwa jumlah substitusi mencerminkan branch length, maka pohon MP merupakan pohon filogenetik yang meminimalisir branch length. Hal ini sesuai dengan filosofi Ockham Razor, "shave away all that is unnecessary". Petuah ini bermakna bahwa evolusi merupakan proses yang efisien, sehingga apabila terdapat lebih dari satu jalur untuk mengarah pada satu hasil maka jalu terpendek-lah yang akan dipilih.

Seiring dengan semakin banyaknya taksa yang ingin diselidiki hubungan kekerabatannya, jumlah kandidat pohon tentu saja meroket dengan cepat. Untuk itu, algoritme MP menggunakan beberapa metode pencarian pohon yang telah dijelaskan sebelumnya, yakni mulai dari Branch & Bound untuk 25 taksa dan Heuristic Approach untuk taksa lebih dari 25 (lihat pada artikel Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Phylogenetic Inference by Maximum Likelihood Method (In Depth)).

D. Keuntungan dan Kerugian Algoritme Maximum Parsimony
Sebagai sebuah algoritme, tentu saja Maximum Parsimony memiliki aspek positif dan negatif.  Berikut saia berikan daftarnya:
- Keuntungan
1. Pohon MP yang direkonstruksi pada umumnya terbebas dari asumsi-asumsi model substitusi nukelotida yang diterapkan pada algoritme lainnya seperti algoritme distance-matrix atau maximum likelihood. Dengan kebebasan asumsi model substitusi ini, pohon MP dinilai lebih dapat menggambarkan hubungan kekerabatan yang sebenarnya ketika divergensi antar sequence cukup rendah.
2. Maximum Parsimony merupakan algoritme character-based yang cukup akurat dengan waktu komputasi yang relatif lebih cepat dari algoritme character-based lainnya seperti maximum likelihood.

- Kerugian
1. Pohon MP dikatakan cukup akurat atau mendekati pohon sebenarnya (true tree) apabila diterapkan dengan serangkaian syarat, yakni: (i) tidak ada back mutation atau parallelism; (ii) laju substitusi antar taksa relatif rendah; dan (iii) jumlah nukleotida dalam sequence sangat banyak. Pada kenyataanya ketiga syarat tersebut sulit untuk terpenuhi oleh dataset yang ada.
2. Adanya tendensi algoritme MP untuk menggabungkan 2 taksa yang memiliki kemiripan sequence nukleotida akibat proses back mutation, parallelism, dan konvergensi. Hal ini dapat terjadi juga akibat ketidaksetaraan laju evolusi antar taksa. Kedua faktor tersebut dapat berakibat pada efek "long branch attraction", yakni penggabungan dua taksa yang berbeda nenek moyang akibat kesamaan laju substitusi nukleotida (Gambar 3). Berdasarkan Gambar 3 tersebut, takson A dan C yang berbeda nenek moyang dalam hal ini bergabung pada nodus internal (nenek moyang) yang sama oleh algoritme MP. Hal ini disebabkan oleh karena perbedaan laju substitusi nukleotida antara takson A yang lebih mirip dengan takson C dibandingkan dengan takson B yang merupakan kerabat takson A yang sebenarnya.

Gambar 3. Long-Branch Attraction.

E. Kesimpulan
Algoritme MP dapat dikatakan sebagai algoritme tertua yang dikembangkan untuk mempelajari hubungan kekerabatan antar mahluk hidup. Seperti hal-nya algoritme lainnya, penerapan konsep parsimony dalam algoritme sequence molekular (DNA/protein) tentunya memiliki serangkaian asumsi sehingga mengakibatkan adanya keuntungan dan kerugian tersendiri dari algoritme ini. Sebagai algoritme character-based, Maximum Parsimony cukup cepat dan akurat dalam merekonstruksi hubungan kekerabatan antar taksa jika menggunakan sequence yang memiliki kekonstanan laju evolusi dan sedikit homoplasi.

Regards,
KohVic

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Bayesian Phylogenetic Inference (In Depth)

Hmm...sebenarnya ada sedikit kekhawatiran dalam diri saia ketika ingin menulis mengenai topik ini. Pertama adalah karena notes-notes yang berjudul Bayesian sudah pernah saia tulisan sebelumnya. Menuliskannya kembali kali ini sepertinya terkesan mengulang-ngulang saja. Kedua adalah, saia khawatir para pembaca setia dan tidak setia seri Bukan Tulisan Ilmiah saia akan segera bosan. Yasuda, saia putuskan untuk melakukan semacam impruvisasi dalam tulisan ini. Judulnya mungkin mirip, tapi saia akan fokus untuk memperdalam isi materinya. Selamat membaca ^^

A. Sebuah Awalan
Bayangkan sebuah pertandingan/kompetisi tahunan tingkat dunia dan selama 14 tahun terakhir ini dimenangkan oleh 7 negara yang sama. Nah sekarang pertanyaannya adalah pada pertandingan ke-15 yang katakanlah diselenggarakan sekarang ini, negara manakah yang akan menang? Seorang yang setia mengikuti pertandingan tersebut pastinya punya pegangan kuat tim mana yang diprediksi akan menang. Namun bagi kita-kita yang mungkin tidak tahu apa-apa mengenai pertandingan tersebut sebenarnya juga bisa menentukan pilihan tim yang cukup meyakinkan untuk menang. Oke, sekarang anggaplah peluang kemenangan hanya terdapat pada 7 negara tersebut dan peluang dimenangkan oleh negara lainnya dapat diabaikan. Dengan memperhatikan sejarah perolehan kemenangan selama 14 tahun terakhir yang sama pada ke-7 negara tersebut, kita dapat memperkirakan bahwa pada pertandingan ke-15 ini satu negara memiliki peluang untuk menang sebanyak 1/7.

Pertandingan tahun ke-15 pun dimulai dan kita pun (mencoba) menonton dengan antusias. Perkiraan pun semakin mendekati kenyataan dan tidak terasa 2 diantara 7 negara tersebut ternyata masuk final!! Nah pertanyaannya sekarang adalah apakah peluang menang kedua negara yang bertarung di final tersebut masih 1/7? Tentunya peluang tersebut sudah meningkat menjadi 1/2 bukan?

Yup, logika Bayesian memang dicirikan dengan kemampuannya untuk memperbarui distribusi kemungkinan sedemikian rupa sehingga mendekati kebenaran. Pada cerita di atas, peluang 1/7 pada tiap negara itu kita sebut sebagai "prior" atau dapat saia definisikan sebagai "perkiraan awal". Sementara itu, peluang 1/7 yang kemudian meningkat menjadi 1/2 setelah diperbarui dengan data-data terkini disebut sebagai "posterior" atau yang dapat saia definisikan sebgai "perkiraan kemudian". Bayesian phylogentic inference dirumuskan sesuai dengan teorema Bayes, yakni:

    Pr[tree|data] = (Pr[data|tree] x Pr[tree]) / Pr[data]

dimana tanda garis vertikal "|" dibaca sebagai "given". Saia langsung merujuk pada bahasa inggrisnya saja agar tidak membingungkan. Dengan demikian pembahasaan rumus diatas adalah: "probability of the tree given the data (posterior) equals the probability of the data given the tree (likelihood) times the probability of the tree and then divided by the probability of the data outcome". Konsekuensi dari pernyataan tersebut adalah bahwa untuk mendapatkan pohon filogenetik yang mencerminkan kekerabatan antar taksa yang sebenarnya (the posterior tree), kita harus mengintegrasikan probabilitas dari seluruh situs untuk sebuah pohon dan kemudian menjumlahkannya untuk keseluruhan kemungkinan pohon yang ada. Hal kedua mungkin untuk dilakukan karena kita tinggal hanya menjumlahkannya saja. Namun demikian, integrasi probabilitas situs antar sequence (Pr[data]) itu yang membuat masalah ini menjadi rumit.

B. Perbandingan antara Maximum Likelihood dengan Bayesian Inference
Tentunya para teman-teman pembaca masih ingat dengan tulisan saia sebelumnya yang menyinggung tentang metode Maximum Likelihood (ML). Kalau belum ingat atau belum baca, ya monggo ditengok. Nah membicarakan metode ML itu akan membawa kita kepada persamaan berikut ini:

    L = L(1) x L(2) x L(3) x ... x L(n)
    atau
    lnL = lnL(1) + lnL(2) + lnL(3) + ... + lnL(n)

Perlu kita ketahui bahwa nilai likelihood L per situs diestimasi untuk sejumlah internal nodes yang terdapat pada pohon yang menghubungkan seluruh taksa. Suatu pohon dengan n taksa mengandung n-2 internal nodes. Mengingat bahwa ada 4 kombinasi jenis nukleotida yang mungkin per situs dalam setiap internal nodes, maka terdapat 4^(n-2) kombinasi nukleotida per situs untuk pohon dengan n taksa. Err..kita baru membicarakan likelihood untuk satu situs bukan? dan tentunya nilai likelihood suatu pohon dihitung dari nilai likelihood setiap situsnya. Nah jumlah internal nodes tersebut, pendek kata, setara dengan kelipatan integral untuk menghitung probabilitasnya. Nah proses integrasi yang berlipat-lipat inilah yang menjadikan metode ML sangat memakan waktu dari segi komputasi bahkan dengan komputer cepat sekalipun.

Metode Bayesian inference, sekalipun menggunakan nilai likelihood L dalam teorema Bayes-nya, tidak secara eksplisit menghitung nilai tersebut. Hal ini dapat dicapai akibat penerapan algoritme Markov Chain Monte Carlo (MCMC) mengestimasi nilai likelihood dari suatu pohon dengan branch length dan model tertentu. Dengan demikian, proses dalam Bayesian inference menjadi lebih cepat di dalam pencarian pohon terbaik (best tree) akibat penerapan MCMC ini.

C. Tahapan Bayesian Inference
Inti dari Bayesian inference adalah analisis probabilitas. Jika likelihood didefinisikan sebagai probabilitas dari suatu data jika diberikan sebuah hipotesis (pohon), maka Bayesian inference ini menggunakan rasio likelihood tersebut untuk menentukan hipotesis (pohon) mana yang lebih mampu menjelaskan data sequence yang kita miliki. Proses MCMC akan menghasilkan serangkaian hipotesis dalam rantaian-nya (chain), masing-masing dengan nilai likelihoodnya. Nilai-nilai likelihood ini dimasukan ke dalam teorema Bayes seperti yang telah dituliskan di atas. Sebagai contoh, anggaplah kita telah memiliki dua nilai likelihood (L1 dan L2) untuk dua hipotesis dan ingin membandingkannya menggunakan teorema Bayes. Dalam perbandingan ini, state yang baru diperoleh (new state / L2) dibandingkan dengan state awalan (current state / L1) untuk diperoleh nilai rasio r nya:

Perhatikan bahwa masing-masing penyebut dari kedua persamaan (Pr[data]) saling menghilangkan satu sama lain sehingga nilai r setara dengan perbandingan kedua nilai likelihhod (L2/L1) dari kedua hipotesis. Jika nilai r lebih besar dari 1 yang berarti state baru memiliki nilai likelihood yang lebih tinggi daripada current state, maka state baru tersebut akan dijadikan sebagai current state yang baru. Apabila nilai r lebih kecil dari 1 maka state yang baru akan diterima dengan probabilitas tertentu. Apabila masih tidak mungkin untuk diterima, maka state baru tersebut ditolak dan current state tetap menjadi current state untuk dibandingkan lagi dengan state baru yang lain.

Algoritme MCMC akan terus menyampling pohon hingga mencapai keadaan dimana tidak diperoleh lagi perbedaan nilai likelihood yang signifikan antar satu pohon dengan lainnya. Nah pada keadaan ini dapat kita katakan bahwa MCMC telah mencapai titik konvergensi. Pada titik konvergensi inilah pohon dengan distribusi posterior didapatkan. Pada umumnya akan terdapat lebih dari satu pohon yang mewakili distribusi posterior ini dan pada akhirnya kita juga yang harus menentukan pohon mana dari sejumlah pohon posterior tersebut yang terbaik menurut kita.

D. Optimasi MCMC
Apabila penjelasan pada sub-bagian C membuat teman-teman pembaca agak bingung, saia akan mencoba menjelaskan dengan sedikit gambar (lihat gambarnya). Telah kita ketahui bahwa akan terdapat sejumlah besar pohon (dengan topologi dan branch length masing-masing) yang mungkin dibuat untuk sejumlah taksa. Masing-masing pohon tersebut memiliki probabilitasnya sendiri untuk menjadi pohon yang benar (likelihood). Nah jika saia mendistribusikan seluruh pohon tersebut dalam sebuah histogram katakanlah, dengan sumbu-Y menyatakan nilai likelihood, maka akan terlihat sebuah topologi distribusi probabilitas antar pohon satu dengan lainnya. Ada puncak yang rendah (likelihhod kurang optimal), ada lembah (nilai likelihood sangat rendah) dan ada juga puncak tertinggi (nilai likelihood optimal). 

Pohon dengan "puncak" tertinggi dalam histogram tersebut (memiliki nilai likelihood tertinggi) merupakan pohon posterior dan merupakan target kita. Nah sekarang permasalahannya adalah rantai MCMC mungkin bisa terjebak pada puncak non-optimal (disebut sebagai local optima) seperti contohnya terjebak di puncak C. Apabila current state likelihood sudah berada di local optima, pembandingannya dengan new state likelihood mungkin akan selalu dimenangkan oleh current state likelihood karena sudah mencapai daerah puncak. Nah pada situasi seperti inilah parameter-parameter tertentu perlu diperhatikan agar terhindar dari local optima.

Parameter pertama adalah mixing behavior. Secara sederhana, mixing behavior dapat disetarakan sebagai variansi antara satu nilai likelihood dengan lainnya. Variansi  yang terlalu kecil menggambarkan bahwa pencarian new state likelihood dilakukan dengan jarak yang begitu dekat dengan current state likelihood sehingga rasio r yang dihasilkan tidak berbeda secara signifikan. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa rantai MCMC berjalan di tempat dan tidak berlanjut ke daerah posterior. Variansi yang terlalu besar pada umumnya menyebabkan new state likelihood sangat berbeda dengan current state likelihood sehingga nilai rasio keduanya lebih kecil dari 1. Sebagai akibatnya, chain akan terus berada pada titik current state likelihood aibat new state likelihood yang selalu ditolak. Dengan demikian, rantai MCMC diam ditempat. Kedua fenomena ini menyebabkan mixing behavior yang buruk. Variansi sedang (adequate) merupakan pertanda yang bagus dalam menandakan bahwa rantai MCMC kita berjalan menuju ke arah posterior.


Parameter kedua adalah Metropolis Coupling MCMC (atau MCMCMC / MC3). Parameter ini berfungsi untuk menghindarkan rantai MCMC kita terjebak pada local optima. Ketidakhadiran MC3 akan cenderung membuat rantai MCMC kita terhenti ketika sudah mencapai suatu puncak tanpa memperdulikan apakah itu hanya sekedar puncak (local optima) atau puncak tertinggi (global optima). Metropolis Coupling MCMC memungkinkan rantai MCMC kita untuk "melompat" dari satu puncak ke daerah lainnya, sehingga membuat rantai MCMC bisa terus mencari daerah posterior yang menjadi global optima.

E. Kesimpulan
Jadi, setelah menuliskan secara panjang x lebar x dalam dibagi jari-jari kuadrat dan diintegralkan, maka dengan ini saia simpulkan bahwa pada intinya  Bayesian Phylogenetic Inference mencari pohon terbaiknya (the best tree) berdasarkan distribusi probabilitas posterior diantara pohon-pohon yang ada. Pohon-pohon yang memiliki probabilitas posterior tertinggi diantara pohon lainnya dianggap merupakan serangkaian pohon yang dapat menggambarkan hubungan filogenetik taksa kajian dengan sama baiknya. Pada akhirnya, semua kembali kepada kita mengenai bagaimana menginterpretasikan distribusi probabiilitas posterior tersebut untuk menggambarkan hubungan kekerabatan antar taksa.

Regards,
KohVic

Further Readings:

- Ronquist, F., P. van der Mark, & J. P. Huelsenbeck. 2009. Bayesian phylogenetic analysis using MRBAYES. In The Phylogenetic Handbook: A Practical Approach to Phylogenetic Analysis and Hypothesis Testing 2nd Edition (P. Lemey, M. Salemi, & A-M. Vandamme eds.). Cambridge University Press: UK.

- Huelsenbeck, J. P., F. Ronquist, R. Nielsen, & J. P. Bollback. 2001. Bayesian Inference of Phylogeny and Its Impact on Evolutionary Biology. Science 294: 2310-2314.

- Yang, Z. & B. Rannala. 1997. Bayesian Phylogenetic Inference Using DNA Sequences: A Markov Chain Monte Carlo Method. Mol. Biol. Evol. 14 (7): 717-724.

- Rannala, B. & Z. Yang. 1996. Probability Distribution of Molecular Evolutionary Trees: A New Method of Phylogenetic Inference. J. Mol. Evol. 43: 304-311.

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Phylogenetic Inference by Maximum Likelihood Method (In Depth)

Hai hai hai...kembali berjumpa dengan saia Chef Victor alias KohVic. Yaa lagi-lagi saia diprotes oleh salah satu pembaca karena lama tidak membuat tulisan terkait filogenetik. Jujur saja saia sampai saat ini belum ada ide untuk membuat tulisan dengan tema baru. Yaa silahkan pikir sendiri alasannya mengapa, bisa mulai dari sibuk mengerjakan tesis hingga sibuk cari teman kencan...hahahaha. Ehem..yaa dalam tulisan kali ini saia hanya ingin mencoba membahas secara lebih mendalam sebuah tulisan yang pernah saia buat pada serial Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni yang lalu, yakni mengenai algoritme Maximum Likelihood (ML).

Pertama, ijinkan saia memaparkan alur pikiran saia dalam tulisan ini. Tulisan ini akan saia mulai dengan definisi konsep likelihood, kemudian dilanjutkan ke penerapan konsep likelihood tersebut dalam konteks filogenetik. Sederhana toh? Oke mari kita mulai dengan sebuah pertanyaan. Apakah itu tepatnya definisi kata "likelihood"? Well, secara intuitif ditambah sedikit pengalaman membuka kamus bahasa inggris tentunya kita akan menebak bahwa kata tersebut berhubungan dengan sesuatu yang cenderung (likely). Nah dalam konteks matematis, kecenderungan itu bisa dikatakan sepadan dengan peluang. Yap, konteks likelihood ini sangat berhubungan sekali dengan peluang. Nah peluang seperti apakah itu.

Mari saia jabarkan dengan satu contoh. Jika kita melempar koin sebanyak 100 kali dan mendapatkan bagian depan sebanyak 21 (d=21), kita dapat menuliskan bahwa peluang munculnya bagian depan adalah p=0,21. Sekarang saia tanya, berapakah peluang saia untuk mendapatkan hasil persis sama (d=21) dalam 100 lemparan koin berikutnya? Dalam hal ini kita dapat menghitungnya dengan persamaan distribusi binomial, yakni:

Prob[H=d] = (n, d) p^d . (1-p)^n-d

dimana: p^d merupakan peluang untuk mendapatkan bagian depan (d) dikalikan dengan peluang untuk tidak mendapatkan d. Karena koin hanya memiliki 2 sisi, maka peluang tidak mendapatkan d adalan 1-p. Nah dari persamaan di atas, kita dapat melihatnya dari dua sisi. Pertama, jika p diketahui maka kita dapat menghitung peluang untuk mendapatkan distribusi hasil yang sama (21 depan, 79 belakang) untuk 100 lemparan ke depan. Kedua adalah, kita telah mendapatkan distribusi hasil depan dan belakang dan nilai p inilah yang justru dicari. Konteks kedua inilah yang dinamakan sebagai likelihood, yakni menghitung probabilitas dari suatu kejadian yang sudah terjadi (probability of the known event) atau sering disebut sebagai reverse probability.

Nah dalam konteks filogenetik, penerapan konsep likelihood ini dijabarkan dengan hipotesis (topologi pohon, branch length, dan model evolusi) seperti apa yang memiliki likelihood terbesar untuk menghasilkan sequence alignment yang kita miliki. Metode ML termasuk ke dalam salah satu metode character-based dengan fungsi optimality search criterion. Artinya adalah metode ini didasarkan pada suatu model evolusi tertentu (JC69, K80, TN93, GTR, dsb) untuk menganalisis likelihood setiap topologi pohon dari setiap situs nukleotida yang ada pada sequence alignment yang kita miliki. Jadi, dalam metode ML kita perlu memasukan model evolusi dan nantinya algoritme ML terebut yang menentukan pohon seperti apakah yang paling dapat 'menjelaskan' sequence alignment yang kita miliki berdasarkan model evolusi tersebut. Hal ini berarti bahwa perbedaan model evolusi yang digunakan dapat mengakibatkan perbedaan pohon yang didapatkan. Suatu pohon ML yang dihasilkan dapat dibandingkan satu sama lain berdasarkan nilai Maximum Likelihood Estimate (MLE) nya. Nilai MLE yang lebih besar menandakan bahwa pohon tersebut dapat menjelaskan sequence alignment kita dengan lebih baik.

Nah sekarang, bagaimana tepatnya tahapan dalam pembuatan pohon ML? Saia akan mencoba menjelaskannya dengan menggunakan 4 taxa/OTU. Berikut adalah sequence alignment untuk ke-4 OTU tersebut:

OTU 1    = AACGCCTTT...N
OTU 2    = AACGCGTTA...N
OTU 3    = AACCAGTTT...N
OTU 4    = AACCGGTTT...N
Sekarang coba lihat situs kelima. Disana secara berturut-turut OTU 1, 2, 3, dan 4 memiliki nukleotida C, C, A, dan G. Nah dengan contoh situs ke-5 ini metode ML merekonstruksi kekerabatan keempat OTU dengan membuat sebuah pohon unrooted dan kemudian memperhitungkan probabilitas nukleotida ancestor (5 & 6) yang menghasilkan state nukleotida seperti yang teramati sekarang ini.
(1)C--+            +--A(3)
           (5)----(6)
(2)C--+           +--G(4)

Kita ketahui bahwa ada 4 jenis nukleotida, yakni A, T, G, dan C. Dengan demikian, jumlah kombinasi nukleotida untuk dua ancestral state tersebut ada 16 (AA, AG, AC, AT...):
(1)C--+            +--A(3)  |  (1)C--+            +--A(3)  | (1)C--+            +--A(3)  |  (1)C--+            +--A(3)
           (A)----(A)            |            (A)----(T)              |           (A)----(C)             |            (A)----(G)
(2)C--+           +--G(4)   |  (2)C--+           +--G(4)   | (2)C--+           +--G(4)   |  (2)C--+         +--G(4) ....

Nah probabilitas dari seluruh kombinasi ini dihitung dengan bantuan data sequence alignment yang ada dan kemudian diakumulasi menjadi nilai likelihood untuk situs nomor 5 (L(5)). Selesai? Tentu saja belum. Metode ML akan menghitung nilai likelihood untuk satu pohon berdasarkan seluruh situs dalam alignment. Dengan demikian nilai likelihood (L) dari satu pohon dirumuskan dengan:

L = L(1) x L(2) x L(3) x ... x L(n)     dengan 1-n = jumlah situs dalam sequence alignment

Pada umumnya nilai L ini begitu kecilnya sehingga dinyatakan dalam bentuk logaritmik (lnL). Dengan demikian, rumusnya menjadi:

lnL = lnL(1) + lnL(2) + lnL(3) +...+ lnL(n)   dengan 1-n = jumlah situs dalam sequence alignment

Oke, sekarang kita telah mendapatkan nilai likelihood L untuk SATU pohon. Selesai? hahaha...tentu saja BELUM. Perlu kita ingat bahwa jumlah kandidat pohon untuk sejumlah OTU itu dirumuskan dengan:

N(U) = (2n-5)! / 2^n-3 . (n-3)! dengan n = jumlah OTU/taxa

Bingung? yaa gambaran mudahnya begini saja. Pada tingkat 4 OTU ada 3 kandidat pohon yang mungkin dibuat [(AB;CD), (AC;BD), & (AD);(BC)]. Nah meningkat ke 10 OTU akan ada 2.027.025 dan pada 20 OTU akan ada 221.643.095.476.699.771.875 kandidat pohon! Cukup banyak bukan? Nah misalnya kita menggunakan metode ML untuk merekonstruksi kekerabatan 20 OTU, itu artinya perhitungan nilai MLE harus dilakukan terhadap total sekitar 2x10^20 pohon tersebut. Komputer cepat pada saat ini pun akaan kewalahan jika disuruh hal seperti itu.

Nah lalu bagaimana solusinya? Saat ini ada dikembangkan 3 metode untuk evaluasi cepat dalam mencari pohon ML tersebut. Metode tersebut adalah (1) Exhaustive Search, (2) Branch & Bound Method, dan (3) Heuristic Approach. Metode Exhaustive Search telah saia jelaskan sebelumnya, yakni membuat seluruh kemungkinan topologi pohon dan mengevaluasi serta membandingkan nilai MLE antar satu pohon dengan yang lain. Metode ini menjamin bahwa pohon ML optimum akan didapatkan, namun demikian butuh waktu yang lama dan metode ini hanya efektif untuk rekonstruksi maksimal 10 OTU.

Ketika rekonstruksi melibatkan 12-25 OTU, maka metode Branch & Bound diterapkan menggantikan Exhaustive Search. Metode ini pada dasarnya mengevaluasi seluruh kemungkinan pohon namun juga memotong jalur rekonstruksi pohon ketika dipastikan bahwa pohon tersebut pastinya memiliki nilai MLE yang lebih rendah. Pemotongan jalur rekonstruksi ini dapat menghemat sebagian waktu komputasi, sehingga memungkinkan metode Branch & Bound cukup efektif hingga 25 OTU. Tahapannya adalah dengan merekonstruksi 1 pohon awal (initial tree) dari 3 OTU hingga n-OTU. Setiap penambahan OTU ke dalam pohon (growing tree) akan diestimasi nilai MLE nya dan terus demikian hingga mencapai 1 pohon lengkap (full tree). Selanjutnya, metode tersebut akan mengulang rekonstruksi dari tahapan 3 OTU. Namun kali ini nilai MLE pada penambahan OTU ke-4 akan dibandingkan dengan nilai MLE pada initial tree. Apabila nilai MLE nya lebih rendah, maka jalur rekonstruksi tersebut tidak akan dilanjutkan dan demikian sebaliknya.

Nah sekarang, bagaimana jika kita ingin merekonstruksi filogeni dengan OTU > 25? Dikatakan bahwa metode Branch & Bound kurang efektif jika diterapkan pada lebih dari 25 OTU. Pada kasus ini pencarian optimal ML tree akan diserahkan pada algoritme berbasis Heuristic Approach. Inti dari algoritme ini adalah berbasis sampling, yakni hanya menggunakan sebagian kandidat pohon dari total pohon yang mungkin direkonstruksi. Berbagai macam algoritme berbasis Heuristic Approach telah dikembangkan, diantaranya meliputi Stepwise Addition, Star Decomposition, dan Branch Perturbations. Saat ini algoritme yang paling umum digunakan adalah berbasis Branch Perturbations, yang selanjutnya terbagi lagi menjadi 3, yakni (1) Nearest Neighborhood Interchange (NNI), (2) Subtree Prunning and Regrafting (SPR), dan (3) Tree Bisection and Reconnection (TBR). Em, saia rasa terlalu panjang untuk membahasnya satu per satu, tapi saia akan kemukakan logika umumnya. Intinya adalah metode Branch Perturbation ini akan merekonstruksi sebuah pohon dan mengestimasi nilai MLE-nya untuk dijadikan sebagai patokan awal. Selanjutnya topologi pohon akan dirubah sedemikian rupa dan kemudian nilai MLE diestimasi kembali. Nilai MLE yang lebih tinggi menandakan bahwa topologi pohon tersebut lebih mampu menjelaskan data dan akan disimpan sebagai patokan yang baru. Branch Perturbation ini akan terus dilakukan hingga tidak didapatkan pohon dengan nilai MLE yang lebih tinggi lagi. Nah perbedaan antara NNI, SPR, dan TBR terletak pada jumlah kombinasi Branch Pertubation yang dapat dibuat. Sebagai hitungan kasar, apabila dengan NNI dapat menghasilkan n kombinasi sampel, maka SPR akan menghasilkan kuadrat-n, dan terakhir TBR akan menghasilkan kubik-n kombinasi sampel. Hmm...TBR kedengarannya cukup meyakinkan bukan. Namun jangan lupa bahwa semakin banyak kombinasi yang dibuat itu berarti waktu komputasi yang semakin lama loh...hehehe

Oke deh, sekian dulu mengenai Maximum Likelihood nya. Semoga dengan tulisan iseng-iseng saia ini kita jadi lebih bisa mengerti dan memahami mengenai algoritme Maximum Likelihood yang terkenal.....lama akan waktu komputasinya itu.

Regrads,
Victor Apriel (KohVic)

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Estimating Selection Pressures on Molecular Sequences (In Depth) Part III

Menikmati kesendirian di kamar kost tanpa tau harus ngapain, jadi begini deh pelariannya. Ehem....tulisan ini merupakan sambungan dari part II kemarin yang dengan sangat terpaksa harus saia batasi hingga estimasi laju tekanan seleksi antar branch karena akan terlalu panjang bila dilanjutkan. Nah dalam part III ini saia akan meneruskannya dengan estimasi laju tekanan seleksi antar site dalam sequence alignment. Selamat menikmati ^^/

Estimasi laju tekanan seleksi pada sequence molekular dapat dipandang sebagai usaha untuk menjawab apakah biomolekul pembawa informasi genetik, yang dalam hal ini adalah DNA, mengalami evolusi secara netral? Kata "netral" yang dimaksud disini adalah tanpa dipengaruhi oleh proses adaptasi terhadap seleksi alam. Teman-teman semua tentunya masih ingat dengan empat pertanyaan yang diajukan pada part I bukan. Nah hingga sekarang ini kita telah menjawab pertanyaan ke-1 dan 2. Pada tulisan ini, saia akan mencoba mengajak teman-teman pembaca untuk menjawab pertanyaan ke-3, yakni estimasi jenis dan laju substitusi antar kodon dalam suatu alignment untuk mencari kodon target manakah yang mengalami proses seleksi. Sebelum kita memasuki inti cerita, saia ingin mengingatkan kembali bahwa kata 'seleksi' ditujukan pada kodon yang mengalami substitusi non-synonimous (beta). Hal ini didasarkan pada pandangan bahwa perubahan suatu asam amino yang disandi oleh kodon yang bersangkutan merupakan bentuk adaptasi organisme untuk menghadapi seleksi alam.

Berdasarkan definisi 'seleksi' di atas, seringkali kita berusaha mencari jenis seleksi yang mengarah pada keberagaman. Hal demikian disebut postitive selection atau diversifying selection; dan diindikasikan dengan nilai omega >1.  Dengan asumsi bahwa organisme (OTU) yang diperbandingkan memiliki keseragaman laju substitusi synonimous antar branch (alfa[b] =1) dan antar site (alfa[s] = 1), maka seleksi positif dapat langsung tergambarkan oleh nilai beta[b] > 1 dan beta[s] > 1.  Secara umum, pengujian bahwa beta[b] > 1 lebih ditujukan untuk mendeteksi ada/tidaknya perbedaan nilai beta pada setiap branch, sedangkan pengujian beta[s] > 1 ditujukan untuk mencari kodon target yang diseleksi.

Beberapa metode telah dikembangkan untuk pengujian ini. Metode-metode tersebut didasarkan pada uji signifikansi dua hipotesis (H0 dan HA) terhadap nilai beta[s] pada masing-masing kodon dalam sequence alignment. Metode-metode tersebut meliputi:
1. Random Effect Likelihood (REL)
2. Fixed Effect Likelihood (FEL)
3. Single Likelihood Ancestor Counting (SLAC) atau Counting Heuristics

1. Metode Random Effect Likelihood (REL)
Metode ini didasarkan pada asumsi bahwa distribusi alfa[s] dan beta[s] dapat di representasikan pada suatu fungsi f. Berdasarkan parameter-parameter yang terdapat dalam fungsi f tersebut, maka seseorang dapat menghitung nilai likelihood setiap fungsi f yang diajukan terhadap data kodon yang dimiliki. Nilai likelihood ini kemudian digunakan dalam uji signifikansi mengenai ada/tidaknya variasi laju tekan seleksi terhadap kodon serta memperkirakan kodon mana yang diseleksi tersebut.

Bayangkan ada sebuah sequence alignment dengan kodon C = 1....s yang masing-masing kodon memiliki nilai alfa[s] dan beta[s]. Metode REL ini akan menekankan bahwa alfa[s] dan beta[s] mengikuti distribusi D yang memiliki sejumlah kategori laju d. Setiap kategori laju d memiliki nilai alfa[d] dan beta [d] yang sudah ditentukan dan probabilitas bahwa alfa[s] = alfa[d] serta beta[s] = beta[d] ditentukan oleh nilai pd, dimana total nilai pd untuk seluruh kategori d adalah 1.

Salah satu contoh aplikasi REL misalnya model M8 pada program Phylogenetic Analysis Using Maximum Likelihood (PAML) buatan Oom Ziheng Yang. Model M8 memiliki D dengan 10 kategori d. Kesepuluh kategori ini masing-masing memiliki nilai alfa[d] = 1 dan sepuluh varian nilai beta[d] yang menghasilkan omega[d] > 1. Dengan demikian, seluruh varian nilai beta[d] haruslah >1. Selanjutnya, model M8 ini diujikan terhadap setiap codon site c pada dataset alignment. Perhitungan ini akan menghasilkan site-by-site likelihood (L) untuk setiap kodon c sehingga kita dapat melihat nilai omega dan nilai likelihood (L)untuk setiap site kodon. Setelah itu, nilai-nilai L ini diuji signifikansinya dengan LRT dan signifikansi suatu site di dalam suatu kodon menandakan bahwa site tersebut diseleksi.

Metode REL ini cukup sensitif dalam penelusuran proses seleksi. REL dapat mendeteksi sebuah diversifying selection hingga tingkat omega = 1,1; suatu hal yang tidak dapat dilakukan oleh metode fixed effect likelihood (FEL; akan dijelaskan kemudian). Namun demikian, metode REL juga memiliki kelemahan. Kelemahan pertama adalah pemilihan kategori d dilakukan secara subjektif (a priori), sehingga sangat mungkin untuk suatu nilai alfa[s] dan beta[s] tidak tercakup dalam kategori alfa[d] dan beta[d] yang ditentukan.

2. Metode Fixed Effect Likelihood (FEL)
Metode FEL menggunakan estimasi langsung nilai alfa[s] dan beta[s] dari dataset dan tidak melakukan estimasi distribusi kedua nilai dalam alfa[d] dan beta[d] seperti halnya pada metode REL. Metode FEL dijabarkan dalam dua tahap. Tahap pertama adalah metode ini mengestimasi parameter-parameter substitusi berdasarkan dataset alignment yang ada, seperti nucleotide substitution bias, codon frequency, dan branch length. Kemudian pada tahap kedua, metode FEL menganggap bahwa setiap site pada kodon (ingat ada 3 site dalam 1 kodon) merupakan hasil substitusi yang independen antar satu dengan lainnya. Dengan demikian, setiap substitusi pada situs di dalam suatu kodon tersebut akan menghasilkan nilai alfa dan beta yang ditulis sebagai alfa[c] dan beta[c].

Selanjutnya, uji signifikansi dilakukan dengan menguji dua buah hipotesis terhadap setiap nilai alfa[c] dan beta[c] pada masing-masing kodon, dimana H0: alfa[c] = beta[c] dan HA: tidak demikian. Hipotesis H0 dan HA pada setiap kodon kemudian diuji dengan LRT satu per satu untuk dilihat signifikansinya. Kodon yang memiliki nilai LRT yang signifikan disimpulkan sebagai kodon yang terseleksi dan situs yang terseleksi dalam kodon pun dapat ditentukan.

Metode FEL memiliki keunggulan bahwa distribusi laju substitusi (alfa[c] dan beta[c]) ditentukan berdasarkan data dan tidak secara a priori seperti halnya pada REL. Kelemahan metode FEL adalah bahwa metode ini hanya dapat diterapkan pada alignment dengan minimal 30 sequence di dalamnya. Selain itu, metode FEL juga hanya dapat diterapkan pada filogeni organisme yang hubungan kekerabatannya relatif dekat atau dengan kata lain yang proses evolusinya belum cukup lama.

3. Metode Single Likelihood Ancestor Counting (SLAC) atau Counting Heuristics
Metode SLAC dilakukan dalam empat tahapan, yakni (i) rekonstruksi ancestral kodon sequences (sequence yang berada pada internal branch) menggunakan parsimony; (ii) penentuan alfa[c] dan beta[c] dengan mengacu pada ancestral sequence terhadap sequence-sequence yang terhubung dengannya; (iii) penentuan nilai substitusi (alfa/beta) rerata yang nantinya akan dijadikan sebagai nilai expected substitution rate under neutral model; dan (iv) uji signifikansi antara nilai alfa[c] dan beta[c] yang teramati (observed) terhadap nilai substitusi rerata (expected). Jika expected > observed, maka dapat dikatakan ada seleksi positif.

Estimasi variasi laju tekanan seleksi menggunakan metode SLAC sangat cepat bahkan dengan dataset yang besar. Namun demikian metode SLAC memiliki banyak asumsi yang diterapkan. Pertama, ancestral codon sequences (tahap i) dianggap merupakan data yang sebenarnya, padahal hal tersebut merupakan hasil proses rekonstruksi yang mungkin mengandung error. Kedua, proses penghasilkan ancestral codon sequence menggunakan teknik parsimony yang mengabaikan adanya multiple base substitution.

Selanjutnya, metode mana yang akan kita pilih untuk estimasi variasi laju tekanan seleksi pada sequence molekular? Well, Oom Kosakovsky Pond dan Oom Frost telah membuktikan bahwa ketiga metode menghasilkan estimasi yang mirip satu sama lain jika analisisnya dilakukan terhadap dataset yang besar. Masalah kemudian muncul ketika kita hanya memiliki dataset yang sedikit, baik dari segi jumlah sequence maupun panjang alignment. Pada kondisi tersebut disarankan bahwa melakukan ketiga metode dan kemudian mencari kongruensinya adalah cara yang tepat.

Oke, kira-kira demikianlah apa yang dapat saia ceritakan. Pada part selanjutnya, yang juga akan menjadi part terakhir judul ini, saia akan menceritakan mengenai perbandingan analisis tekanan seleksi pada dua gen. Ditunggu yax..heheh

Regards,
Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Estimating Selection Pressures on Molecular Sequences (In Depth) Part II

Terjebak di warnet yang ramai dan tidak sejuk memang menghambat proses pembuatan tulisan secara signifikan, apalagi kalau itu adalah tulisan-tulisan untuk artikel Bukan Tulisan Ilmiah. Yasudah, toh kenyataannya saia sidah terlanjur terjebak disini, jadi saia paksakan untuk menulis saja deh. Pada tulisan sebelumnya kita telah mengenal model evolusi/substitusi kodon, estimasi laju substitusi synonimous dan non-synonimous. Rasio antara kedua laju substitusi tersebut akan menggambarkan jenis seleksi yang berperan terhadap target gen yang dianalisis. Pada tulisan kali ini sai akan menyinggung mengenai estimasi variasi laju tekanan seleksi antar branch dan antar site pada pohon filogenetik.

Mengapa ada variasi laju tekanan seleksi antar branch (organisme/kelompok organisme) dan antar site (kodon pada alignment sequence)? Ya hal itu saia rasa memang wajib ada mengingat beberapa sebab yang telah dikemukakan pada tulisan sebelumnya:
1. Laju evolusi terbukti berbeda antar organisme seperti yang tergambarkan dari perbedaan branch length yang menghubungkan antar organisme/OTU. Hal ini dapat dipandang sebagai ada perbedaan dalam tekanan seleksi terhadap setiap organisme/branch yang mungkin terekam dalam sequence-nya.
2. Mutasi merupakan salah satu faktor utama dalam evolusi, maka perbedaan laju mutasi pada tingkat nukleotida merupakan penyebab utama perbedaan laju evolusi dan pada akhirnya tekanan seleksi baik pada tingkat sequence DNA maupun tingkat organisme.

Diangkatnya tema ini bermula dari sebuah pertanyaan apakah ada perbedaan tekanan seleksi antar organisme atau antar kodon dalam sebuah sequence dalam sebuah pohon filogenetik. Solusi atas pertanyaan tersebut dapat dijawab dengan tahapan berikut: pengasumsian model sebagai hipotesis dan pengujian hipotesis. Pada paragraf ini, saia akan mencoba membahas variasi tekanan seleksi antar branch terlebih dahulu. Analisis tekanan seleksi antar brach dapat digambarkan dalam 3 model/hipotesis, yakni:
1. Local/Free Ratio Model, mengasumsikan nilai omega (beta/alfa) berbeda pada semua branch. Oleh karena itu, model ini mengestimasi nilai omega untuk masing-masing branch.
2. Global/Single Ratio Model, mengasumsikan satu nilai omega untuk semua branch sehingga model ini hanya perlu mengestimasi satu nilai omega rerata dari seluruh branch.
3. Intermediate Complexity Model, mengasumsikan adanya kesamaan nilai omega antar branch dalam clade yang sama. Model ini dapat dikatakan sebagai pertengahan antara local dengan global model, karena hanya mengestimasi omega per sejumlah clade.

Berdasarkan ketiga model ini, kita kemudian melakukan uji signifikansi. Global ratio model yang tidak mengasumsikan adanya perbedaan laju tekanan seleksi merupakan model yang cocok untuk dijadikan sebagai hipotesis awal (H0) dan local atau intermediate model merupakan hipotesis alternatifnya (HA). Uji signifikansi kedua hipotesis ini dilakukan dengan metode Likelihood Ratio Test (LRT) yang didasarkan pada nilai likelihood atas kedua model yang diperbandingkan. Sebagai pengingat, nilai likelihood mencerminkan besarnya kemungkinan suatu model menghasilkan data yang dimiliki. Model yang semakin cocok terhadap data akan memiliki nilai likelihood (L) yang semakin tinggi. Bab Memilih Model Evolusi pada Serial Tulisan Evolusi dan Filogeni dapat memberikan gambaran yang lebih rinci mengenai LRT ini. Apabila dalam pengujian signifikansi tersebut HA > H0, maka H0 ditolak atas HA. Perlu diingat juga bahwa hal ini tidak berarti HA merupakan jawaban terbaik, namun bahwa data yang dimiliki tidak cocok untuk dapat diterangkan oleh H0 jika dibandingkan dengan HA.

Kelemahan uji LRT ini adalah bahwa pengujian ini dapat memberikan kesimpulan yang salah apabila heterogenitas laju tekanan seleksi sangat kuat antar branch. Kesimpulan mengenai adanya variasi laju tekanan seleksi mungkin tidak akan tercapai apabila hanya sedikit branch yang mengalami tekanan seleksi yang sangat kuat akibat tertutup oleh branch lainnya (background) yang tidak mengalami tekanan seleksi yang kuat. Kedua, kesimpulan yang ditarik dari uji signifikansi ini adalah jawaban atas pertanyaan "apakah ada variasi laju tekanan seleksi antar branch?" dan bukan "dimanakah variasi laju tekanan seleksi itu terjadi antar branch?". Namun demikian, seringkali justru kita menginginkan jawaban atas pertanyaan kedua daripada pertama. Hal tersebut dapat dicapai dengan estimasi nilai omega pada setiap branch (terminal dan internal) dan kemudian melakukan uji signifikansi pada setiap kombinasi pasangan branch yang ada dalam suatu pohon (sebagai gambaran, sebuah pohon dengan 10 OTU memiliki 10 branch terminal dan 8 branch internal). Pengujian LRT secara lokal ini pun memiliki kelemahan karena pembandingannya yang bersifat pasangan (pairwise) dan tidak mempertimbangkan branch lainnya, sehingga mungkin sekali untuk menyimpulkan hal yang salah.

Setelah membanding-bandingkan antar model dan melakukan uji LRT, sekarang mari kita mencoba melirik hal lainnya yang terkait dengan intermediate complexity model. Pada intermediate complexity model, pengujian seluruh branch (B) seperti halnya pada local model direduksi menjadi hanya beberapa branch saja (F), dimana F < B. Namun demikian, branch manakah yang harus dipilih untuk pengujian ini? Pada umumnya ada dua pendekatan yang dilakukan oleh orang-orang yang mengkaji hal ini, yakni pemilihan secara a priori dan pemilihan berdasarkan hasil uji sebelumnya.

Pemilihan branch secara a priori dapat dilakukan berdasarkan informasi-informasi yang terkait dengan data. Salah satu contohnya apabila kita ingin membandingkan adanya perbedan laju tekanan seleksi pada virus HIV yang menginfeksi berbagai mamalia, maka kita dapat berinisiatif bahwa tekanan seleksi pada sequence HIV manusia kemungkinan lebih besar dibandingkan dengan mamalia lainnya seperti kera atau babi. Hal ini dapat disebabkan oleh penggunaan obat anti-retroviral yang dalam hal ini berperan sebagai agensia penyeleksi pada strain virus HIV manusia. Dengan latar belakang tersebut kita dapat memilih dan memilah setiap branch yang ada menjadi kelompok branch tertentu, menghitung nilai omega (branch omega), dan kemudian menguji signifikansi nilai-nilai omega kelompok branch tersebut dengan LRT. Hasil yang signifikan menyimpulkan adanya perbedaan tekanan seleksi yang terjadi antar dua branch yang dibandingkan.

Pemilihan branch berdasarkan hasil pengujian sebelumnya disebut juga dengan data-driven branch selection atau data dredging. Ini berarti bahwa pemilihan branch dilakukan setelah dilakukan estimasi nilai omega terlebih dahulu pada setiap branch dan berdasarkan hasil tersebut baru dipilih kelompok omega yang berbeda secara signifikan untuk kemudian diujikan kembali. Perlu diketahui bahwa teknik seperti ini sebaiknya dihindari karena hipotesis yang disusun berdasarkan dataset dan kemudian diujikan kembali menggunakan dataset yang sama akan selalu menghasilkan bias (terlihat signifikan padahal sebenarnya tidak demikian).

Salah satu cara yang cukup objektif untuk branch (B) ke dalam kelompok jenis model (C) dapat dilakukan dengan metode Stirling Numbers S(C; B), yakni jumlah cara untuk memasukan branch B ke dalam salah satu model C. Nilai Stirling Numbers meningkat dengan cepat, sehingga pengujian LRT yang membandingkan per dua buah model (nested model) H0 dan HA kurang dapat diandalkan. Sebagai alternatif, pembandingan model dilakukan dengan metode teknik skoring menggunakan Small Sample Akaike Information Criterion (AICc). Teknik ini memperhitungkan nilai likelihood, jumlah site alignment, dan model parameter. Skor tinggi, yang berarti modelnya cocok, direpresentasikan dengan nilai likelihood sebesar mungkin namun dengan jumlah parameter yang sekecil mungkin.

Oke, akhir dari cerita. Cukup panjang juga yak. Dari tulisan ini saia dapat menyimpulkan bahwa pengujian mengenai ada atau tidaknya perbedaan laju tekanan seleksi antar branch dilakukan secara statistik menggunakan LRT. Namun demikian, pengujian ini harus didukung  pemilihan hipotesis serta branch/kelompok branch dengan dasar yang jelas. Pemilihan model atau branch yang salah dapat mengakibatkan konstruksi simpulan yang salah juga mengenai ada/tidaknya perbedaan laju tekanan seleksi tersebut. Next time, masih dengan judul yang sama, saia akan coba membahas lebih mendalam lagi hingga pada estimasi perbedaan laju tekanan seleksi antar situs dalam sequence alignment. Ditunggu yax ^^

Regards,

Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Estimating Selection Pressures on Molecular Sequences (In Depth) Part I

Hai hai hai...jumpa lagi bersama saia Chef Victor dengan segala kalimat pembuka tulisannya yang terus berulang-ulang dan nampak membosankan...hahaha. Okeh to the point sajah, dalam tulisan kali ini saia ingin mencoba melunasi 'hutang' saia terkait dengan tulisan sebelumnya. Pada tulisan sebelumnya terlihat bahwa saia terkesan begitu polosnya dan belum dapat mengerti dan memahami keseluruhan tulisan dari sebuah bab buku The Phylogenetic Handbook yang berjudul "Estimating selection pressures on molecular sequences". Nah kali ini, tepat 16 hari sesudah postingan tulisan tersebut, saia ingin kembali mencoba pemahaman saia dengan mencoba menceritakannya kepada kalian-kalian ini. Kalau kalian mengerti, maka itu artinya saia berhasil. Namun apabila kalian belum mengerti, itu artinya kalian yang kurang belajar...hahaha. Yasuda, selamat menikmati ^^

Tulisan ini akan saia mulai dengan 4 buah pertanyaan terkait peranan tekanan seleksi terhadap sequence molekular beserta jawaban singkatnya untuk memandu kita dalam menelusuri keseluruhan tulisan ini:
1. Apa bukti adanya seleksi terhadap sebuah gen? Kita dapat menentukan ada atau tidaknya seleksi dengan mengukur laju substitusi non-synonimous (substitusi nukleotida yang berakibat tergantinya asam amino yang di-translasi; beta) terhadap laju substitusi synonimous (substitusi nukleotida yang tidak mengganti asam amino yang di-translasi; alfa). Adanya seleksi dapat ditentukan dengan rasio kedua laju ini (beta/alfa = omega), yakni omega > 1 atau omega < 1.

2. Kapankah seleksi terjadi? Kita dapat mengukur variasi nilai omega antar cabang (branch) yang ada pada pohon filogenetik. Dengan demikian kita dapat menyimpulkan kapan suatu seleksi berlangsung. Estimasi waktu ini dapat diindikasikan oleh lokasi branch di dalam pohon yang kemudian di estimasi waktunya dengan analisis molecular clock).

3. Dimanakah letak tejadinya seleksi? Kita dapat mendeteksi terjadinya seleksi pada gen dengan menganalisis laju subtitusi syn/non terhadap setiap kodon yang ada pada alignment sequence molekular dan kemudian mentarget kodon mana yang bertanggung jawab terhadap hal tersebut.

4. Apakah gen yang berbeda mengalami tekanan seleksi yang berbeda? Kita dapat menjawabnya dengan membandingkan dua jenis dataset sequence menggunakan model analisis yang sama dan kemudian menguji signifikansinya dengan uji statistik.

Sebelum menjawab empat pertanyaan tersebut ada beberapa istilah yang harus diketahui terlebih dahulu mengenai seleksi. Seleksi terhadap sequence molekular terbagi menjadi tida, yakni seleksi positif (diversifying), seleksi netral, dan seleksi negatif (purifying). Seleksi positif adalah suatu kondisi seleksi yang memungkinkan varian-varian sequence molekuar dapat bertahan hidup. Hal inilah yang menyebabkan adaya 'keanekaragaman' tingkat sequence pada gen yang sama. Perlu diketahui bahwa varian-varian tersebut juga memiliki tingkat ketahanan hidup (survival rate) yang beraneka ragam. Dalam hal ini seleksi negatif merupakan kebalikan dari seleksi positif, yakni menyeleksi varian-varian dengan tingkat ketahanan hidup yang berada di bawah suatu batas tertentu. Seleksi netral merupakan titik tengah antara seleksi positif dan negatif. Parameter substitusi non-synonimous (beta) pada suatu kodon dipakai sebagai parameter seleksi ini dan kita akan simak rinciannya pada paragraf selanjutnya.

Oke, sekarang mari kita telusuri secara lebih mendalam lagi jawaban-jawaban tersebut. Sebagai awalan, teman-teman yang setia mengikuti serial Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni ini pastinya sudah mengetahui bahwa model evolusi yang telah dikenal sejauh membacanya adalah model evolusi nukleotida (Jukes-Cantor, Kimura, dll) dan model evolusi asam amino (Dayhoff, Jones-Taylor-Thornton, Poisson, dll). Namun dalam analisis seleksi ini, kita akan menggunakan model evolusi yang menggabungkan keduanya (kalau boleh saia simpulkan seperti itu), yakni model evolusi kodon. Sebagaimana yang telah kita ketahui, kodon atau kode genetik berisi 64 kode kombinasi triplet nukleotida yang menyandi 20 jenis asam amino. Sebagai konsekuensinya ada beberapa kodon menyandi asam amino yang sama, contohnya adalah kodon AUA, AUC, dan AUU menyandi asam amino isoleusin (Ile).

Sekarang bayangkan apabila suatu kodon GAA mengalami mutasi titik (point mutation). Mutasi ini akan menyebabkan kodon AAG memiliki 9 kemungkinan untuk berubah, yakni menjadi AAA, CAA, GCA, GGA, GTA, GAC, GAG, GAT, dan TAA. Lebih lanjut lagi, hanya mutasi GAA --> GAG yang bersifat synonimous, yakni sama-sama menghasilkan asam glutamat (Glu). Delapan kemungkinan lainnya merupakan mutasi non-synonimous. Nah singkatnya, model evolusi kodon menggunakan distribusi kemungkinan ini untuk diterapkan pada alignment sequence yang ada.

Ada tiga pendekatan yang dilakukan dalam model evolusi kodon ini, yakni pendekatan distance, pendekatan maximum likelihood, dan pendekatan Bayesian. Terlepas dari rincian bagaimana mekanismenya, inti dari setiap pendekatan tersebut adalah untuk mengestimasi nilai beta dan alfa. Selanjutnya, kita dapat menguji apakah terdapat seleksi pada sequence yang kita miliki dengan melakukan uji perbandingan antara dua hipotesis menggunakan Likelihood Ratio Test (LRT). Metode LRT pada prinsipnya adalah menguji signifikansi antara dua hipotesis, yakni H0 = tidak terdapat seleksi (alfa = beta) dan HA = tidak demikian (alfa tidak sama dengan beta). Selanjutnya data yang didasarkan pada H0 dan HA masing-masing diukur nilai likelihood (L) nya. Nilai LRT kemudian dihitung dengan rumus: LRT = 2 (logL HA - logL H0) dan dinyatakan apakah nilainya melewati batas signifikansi atau tidak. Jika ya, berarti H0 ditolak atau singkatnya terjadi seleksi pada sequence yang kita miliki.

Horeee...kira-kira begitulah versi jawaban yang lebih rinci atas pertanyaan yang pertama. Jika kita cukup kurius atau ingin tahu, kita tentu tidak cukup puas dengan jawaban "ada seleksi pada sequence loe bro, trus gue harus bilang WOW gituh...". Jika memang ada seleksi, kita pun lantas mempertanyakan lebih lanjut, "kapan dan dimanakah seleksi itu terjadi pada sequence tersebut"? Ini merupakan pertanyaan nomor dua dan tiga di atas, namun saia berencana akan membahas rincian jawaban atas dua pertanyaan ini pada tulisan berikutnya agar tulisan ini tidak terlalu panjang dan bikin ngantuk. Ditunggu yahhh.

Regards,

Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Estimating Selection Pressures on Molecular Sequences

Hai..hai..hai..jumpa lagi bersama Chef Victor dalam Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni. Setelah lama vakum karena belum menemukan ide untuk menulis, akhirnya saia coba menulis mengenai pengukuran tekanan seleksi terhadap sequence molekular. Well, sebenarnya sih tulisan ini hanya bagian luarnya saja karena saia pun masih belum mengerti seluk-belut nya..heheh. Yaa daripada tidak ada yang bisa ditulis, toh lebih baik menulis apapun yang berhasil dimengerti toh. Okelar, cukup basa-basinya dan selamat menikmati.

Jika pada tulisan sebelumnya kita telah berhasil membuat pohon filogenetik, menguji tingkat kepercayaan, dan kemudian memetakan waktu divergensi; maka akan muncul suatu pertanyaan yang menggelitik dalam benak kita, yakni "bagaimana mereka bisa berdivergensi?". Kita mungkin dapat menjawabnya dengan melakukan analisis sequence DNA dan memetakan substitusi-substitusi yang terjadi diantara daerah dalam aligned sequence dan mempresentasikannya sebagai sebuah pengukuran tekanan seleksi terhadap sequence tersebut. Namun demikian, substitusi pada daerah manakah yang bertanggung jawab dalam proses divergensi antara satu organisme dengan lainnya?

Saia mencoba untuk menjawab pertanyaan diatas dalam 3 tahapan, yakni: (1) Model substitusi kodon; (2) pengukuran laju variasi antar cabang (branch); dan lebih mendalam lagi pada (3) pengukuran laju variasi antar daerah dalam sequence DNA. Model evolusi kodon memberikan kelebihan dibandingkan model evolusi DNA atau protein dalam aspek bahwa kodon merupakan penghubung antara DNA dengan protein. Perubahan nukleotida pada gen struktural dapat atau tidak dapat menyebabkan perubahan pada protein yang disandi bergantung pada kodon yang bersangkutan, sehingga dikenal synonimous substitution dan non-synonimous substitution. Berdasarkan hal ini, kita dapat memperoleh gambaran bagaimana suatu protein target diseleksi, yakni dengan membandingkan rasio laju substitusi non-synonimous terhadap laju substitusi synonimous (b/a = w). Metode perhitungan pada model evolusi kodon terbagi menjadi distance-based approaches dan maximum-likelihood approaches. Dengan kedua metode ini kita dapat mengetahui apakah jenis seleksi terhadap gen tersebut, yakni apakah diversifying (w > 1), netral (w = 1), atau purifying (w < 1).

dimana: b = beta; a = alpha; w = omega


Metode penentuan tekanan seleksi dapat dianalisis dengan baik menggunakan model evolusi kodon dengan segala optimasinya. Namun demikian, hal tersebut tidak memberikan gambaran mengenai tingkat kesetaraan tekanan seleksi di semua titik percabangan (node) dalam pohon filogenetik serta tidak memberikan informasi mengenai posisi kodon yang diseleksi. Kesetaraan tekanan seleksi dalam hal ini dapat dibuktikan dengan penggunaan model evolusi kodon pada setiap titik percabangan, membandingkan nilai antar cabang, dan kemudian memetakannya secara utuh dalam satu kesatuan pohon filogenetik. Lebih mendalam lagi, setelah diketahui tekanan seleksi pada setiap titik percabangan, kita dapat mencari kodon mana yang menjadi target seleksi dalam sequence yang diperbandingkan.

Hmm...okelar sampai segini dulu mengenai apa yang dapat saia ceritakan mengenai analisis tekanan seleksi terhadap sequence molekular. Masih banyak lagi rincian analisis dari setiap tahapan tersebut yang saia sendiri juga masih belum mengerti mekanismenya..heheh.

Regards,
Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Codon Substitution Models

Hmm...oke setelah sekian lama absen menulis artikel Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni, saia kemudian dituntut oleh salah satu pembaca untuk kembali melanjutkan tulisan itu. Nah permasalahannya cukup kompleks karena dalam hal ini saia belum ada ide mengenai apa yang ingin saia tulis. Namun ketika sore kemarin saia bertapa di kamar mandi, datanglah ide yang saia tunggu-tunggu itu. Dalam tulisan kali ini saia lebih cenderung mengutarakan kegundahan serta kegalauan hati saia selama ini. Lho, lantas apa hubungannya dengan tema tulisan diatas? Yaaa....selamat membaca kalau begitu. Duh mules neh, bentar yak...

Kegundahan dan kegalauan saia berawal ketika saia membaca bab yang membahas mengenai pengukuran tekanan seleksi pada sequence molekular. Nah dari sana saia pun diperkenalkan dengan suatu model evolusi yang berbeda dengan dua kelompok model evolusi yang telah saia kenal sebelumnya, yakni model evolusi nukleotida dan model evolusi asam amino. Model evolusi yang baru dan dikatakan juga lebih realistik tersebut adalah model evolusi kodon.

Model evolusi nukleotida menggunakan algoritme substitusi basa A, G, C, T berdasarkan data laju substitusi relatif dan juga frekuensi dari masing-masing basa. Berbagai model mulai dari yang sederhana seperti Jukes & Cantor (JC69) hingga General Time Reversible (GTR) pun tersedia untuk dapat kita pilih dalam analisis data yang dimiliki. Sementara itu, model subsitusi asam amino sedikit berbeda dengan model subsitusi nukleotida karena merupakan sebuah matriks skor untuk masing-masing jenis asam amino standar satu sama lain. Skor yang negatif dalam matriks tersebut artinya kecil kemungkinan terjadi substitusi antara dua asam amino yang terlibat. Contohnya adalah triptofan menjadi aspartat atau sebaliknya dengan skot -4. Untuk lebih rincinya lagi, silahkan cek ke warung kopi...ehh...literartur terkait.

Nah pada model evolusi kodon kali ini saia dapat menyimpulkan model ini menggunakan gabungan model nukleotida dan asam amino. Tidak seperti dua kelompok model sebelumnya, saia belum mendapatkan keterkaitan antara model evolusi kodon ini dengan rekonstruksi pohon filogenetik. Yah daripada pulang dengan otak hampa, lebih baik saia mencoba menceritakan apa yang saia ketahui (belum mengerti atau pahami lohh) hingga saat ini. Pada umumnya model evolusi kodon dipakai dalam penentuan tekanan seleksi terhadap sebuah sequence DNA. Sebelum menceritakan bagaimana logika kerjanya, ada beberapa persyaratan yang harus dipenuhi dalam penggunaan model ini. Prasyarat itu meliputi (1) Model ini membutuhkan data sequence nukleotida sebagai data utamanya dan sequence asam amino (hasil translasinya) sebagai pengkonfirmasi dan (2) Sequence yang digunakan harus dipastikan terbebas dari mutasi frameshift.

Sekarang mari kita bergerak mengenai cara kerjanya. Nah sekarang mari kita bayangkan sebuah kodon (triplet nukleotida) AAA. Kodon AAA tersebut jika ditranslasikan akan menghasilkan asam amino lysine. Nah kemudian coba bayakngkan lagi apabila terjadi mutasi titik pada salah satu dari tiga nukleotida. Mutasi titik pada satu posisi dalam triplet tersebut akan menghasilkan 9 kemungkinan yang akan menghasilkan asam amino berbeda apabila ditranslasikan. Jadi, jika AAA mengalami mutasi titik maka kemungkinannya akan menjadi GAA, CAA, TAA, AGA, ACA, ATA, AAG, AAC, AAT. Nah dari 9 kemungkinan hasil mutasi titik tersebut hanya ada satu mutasi (AAA --> AAG) yang translasinya tetap berupa asam amino lysine. Sisa delapan kemungkinannya merupakan mutasi non-synonimous yang menghasilkan asam amino selain lysine. Setelah memperhitungkan kemungkinan mutasi synonimous dan non-synonimous dari setiap triplet nukleotida, model ini kemudian menghitung nilai rasio dN/dS.

Rasio dN (rerata mutasi non-synonimous) terhadap dS (rerata mutasi synonimous) merupakan salah satu parameter dalam estimasi tekanan seleksi pada sequence molekular. Nilai dN/dS >1 menyatakan bahwa seleksi alam memperbolehkan adanya diversivikasi atau disebut juga sebagai seleksi positif; sedangkan nilai dN/dS<1 manyatakan adanya gejala purifying/negative selection, dimana seleksi alam hanya memperbolehkan sequence tertentu untuk dapat diteruskan pada keturunan berikutnya. NIlai dN/dS=1 menyatakan bahwa evolusi bersifat netral. Beberapa algoritme model substitusi kodon yang dikenal umumnya meliputi Muse-Gaut (MG94), Goldman-Yang (GY94), Nielsen-Yang (NY98), Yang-Nielsen (YN98), dan codon-GTR (CGTR). Software yang menyediakan model evolusi kodon untuk analisis sequence diantaranya meliputi Pylogenetic Analysis using Maximum Likelihood (PAML) dan Important Quartet Puzzling and NNI Optimization (IQPNNI).

Kesimpulan dari cerita diatas adalah bahwa model evolusi menggunakan kodon dibandingkan dengan nukleotida atau asam amino bersifat lebih realistis dalam menentukan bagaimana proses evolusi yang berlangsung terhadap suatu gen struktural. Walaupun evolusi paling dasar terjadi pada DNA, namun target dari seleksi alam adalah protein. Seleksi terhadap protein yang sejatinya merupakan produk DNA mensyaratkan harus adanya suatu adaptasi molekular pada sequence DNA agar dapat menghasilkan varian protein lain yang mampu beradaptasi. Pembacaan sequence DNA dalam bentuk kodon menjawab hubungan DNA-protein ini, sehingga kita bisa mendapatkan gambaran mengenai bagaimana seleksi alam terhadap suatu gen tertentu.

Nah kalau seandainya demikian, sekarang adalah bagian yang membuat galau. Apabila kita ingin merekonstruksi sebuah filogeni menggunakan gen struktural yang mengkode protein elongation factor 1a (EF-1a), lantas model evolusi manakah yang digunakan? Ketika jaman dahulu, saia diceritakan bahwa penggunaan model evolusi protein untuk suatu gen penyandi protein (gen struktural) lebih baik dibandingkan menggunakan model evolusi DNA. Hal ini disebabkan karena model evolusi protein memuat lebih banyak kombinasi substitusi asam amino (20 jenis asam amino dibandingkan dengan 4 jenis nukleotida),  dan juga mempertimbangkan bahwa target evolusi dalam konteks molekular adalah protein dan bukan DNA. Nah kemudian, bagaimana keunggulan model evolusi kodon dibandingkan engan protein? Sekilas saia mendapatkan gambaran seperti yang saia tulis pada paragraf sebelumnya bahwa model evolusi kodon lebih baik dibandingkan DNA dalam hal gen struktural karena memuat 64 kombinasi triplet nukleotida. Namun saia belum mendapat bayangan apabila dibandingkan dengan protein.

So.....ada yang bisa membantu saia menjawab kegalauan ini? :)

Regards,
Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Red Chop and Bayesian Inference (In Depth) Part II

Oke setelah teman-teman membaca Part I, kita akan melanjutkan dengan Part II nya. Hmm..disini saia akan mencoba melanjutkan ke tahapan burn-in, mixing, dan chainswap. Tapi sebelumnya mari kita sedikit me-refresh khususnya mengenai konsep MCMC pada pencarian pohon filogenetik.

A. The Real Case
Inti dari penggunaan Markov Chain Monte Carlo (MCMC) dalam pencarian pohon diantara jutaan pohon lainnya adalah mencari sebuah konvergensi, yakni pencarian menuju kumpulan pohon yang dipandu oleh data yang ada. Dalam prosesnya MCMC meletakan banyak titik secara acak dalam ruang berdimensi-3 dan kemudian menghitung probabilitas masing-masing titik hingga pad akhirnya titik-titik tersebut akan menuju ke satu arah yang sama. Nah proses ini apabila digambarkan dalam grafik akan membentuk seperti kurva hiperbolik.

Kemudian, apakah itu burn-in, mixing dan swapping? Mari kita saksikan pengertian ketiganya.

1. Burn-in
Pada dasarnya proses MCMC menggunakan nilai likelihood (L) untuk membandingkan antara titik satu dengan yang lain. Apabila proses generasi titik berikutnya memiliki nilai (L) lebih besar dari titik awal, maka titik baru tersebut menjadi titik awalnya. Nah dengan cara seperti itu, maka titik-titik yang awalnya memiliki nilai L rendah akan bergerak naik dan pada akhirnya mengumpul pada satu tempat dengan masing-masing memiliki nilai L yang tinggi. Pada kenyataannya nilai L melesat begitu cepat sehingga pengukurannya perlu dilakukan menggunakan skala logaritmik (lnL). Dalam hal ini, hanya titik-titik dengan nilai lnL yang tinggi yang kita perlukan karena hal tersebut mencerminkan kita sudah mendapatkan pohon yang benar. Nah proses burn-in ini membuang titik-titik yang memiliki nilai lnL rendah yang terdapat di awal fase MCMC. Perlu diingat bahwa masing-masing titik tersebut mencerminkan pohon dengan topologi dan branch length-nya.

2. Mixing
Kita mungkin sudah senang karena ternyata proses MCMC menghasilkan konvergensi titik-titik tersebut ke arah yang sama, masing-masing dengan nilai lnL yang serupa tingginya. Eits tapi tunggu dulu, karena perkaranya terdapat lebih dari satu titik/pohon yang berkonvergensi di daerah tersebut. Dalam hal ini, analisis Bayesian menyarankan bahwa poin penting dalam penentuan konvergensi tidak semata hanya melihat daerah dimana titik-titik berkonvergensi namun juga apakah daerah konvergensi tersebut tercakup seluruhnya oleh titik-titik tersebut. Nah maka dari itu kita perlu memperhatikan mixing.

Saia dapat menganalogikan mixing itu sebagai sebuah kurva normal untuk katakanlah distribusi tinggi badan murid-murid dalam satu kelas. Apabila ada suatu kompetisi olahraga yang mengharuskan para pesertanya memiliki tinggi badan 175-185 cm, maka suatu seleksi diperlukan untuk menyaring para murid sehingga didapatkan konvergensi, yakni murid-murid dengan tinggi badan antara 175-185 cm. Muridnya dalam hal ini pasti lebih dari satu dan mixing yang bagus adalah distribusi murid yang dapat mencakup seluruh kisaran tinggi yang dipersyaratkan tersebut. Distribusi murid yang seluruhnya di 185 cm atau seluruhnya di 175 cm (konvergensi satu titik) menandakan mixing yang tidak bagus.

Lantas apa tujuan dari mixing? Well, bagus atau tidaknya mixing menandakan apakah proses MCMC tersebut mendapatkan sampel yang representatif untuk menggambarkan distribusi posteriornya. Dalam hal ini distribusi posterior yang dimaksud adalah pohon filogenetik yang paling menggambarkan filogeni antar taxa.

3. Chainswaps
Lagi-lagi, proses MCMC mungkin tidak berjalan semulus yang diperkirakan. Apabila kita membayangkan sebuah bentang lahan yang berisi barisan pegunungan, lembah dan bahkan jurang; kita akan berharap proses MCMC mengumpulkan titik-titik acak ke satu gunung yang tertinggi pada bentang lahan tersebut. Namun pada kenyataanya ada satu atau beberapa titik yang terjebak pada salah satu gunung yang tinggi (nilai lnL yang tinggi) namun bukan gunung yang optimal. Nah apabila hal ini terjadi pada banyak titik dan titik-titik tersebut terjebak pada banyak gunung yang berbeda, maka dapat dibayangkan betapa kita akan dipusingkan dengan distribusi posterior yang diberikan oleh titik-titik tersebut. Untuk mengatasi hal ini, proses chainswaps diperlukan untuk "memindahkan" satu atau sekelompok titik antar gunung sehingga pada akhirnya titik-titik tersebut dapat berkonvergensi seluruhnya dan memberikan distribusi posterior yang representatif.

B. Sebuah Analogi Poseterior
Oke, mungkin hal-hal seperti itu yang menjadi pelengkap dalam optimasi analisis Bayesian dalam filogenetik menggunakan program MrBayes. Sebagai penutup, ijinkan saia bercerita mengenai sebuah analogi yang lagi-lagi tentang.....cewe itu.

Kembali kepada saia, sang cewe dan amplas; namun kali ini kondisinya dibuat agak lebih sulit dan tentu saja merupakan sebuah rekaan. Anggap saja saia sudah punya banyak data mengenai deskripsi si cewe yang ingin saia pedekate itu. Datanya apa? mau tau ajah. Berbekal data tersebut saia akan mampu mengenali si cewe pada tempat dan waktu tertentu apabila kami bertemu. Nah celakanya, ketika di amplaz ternyata saia menemukan anggap saja 100 cewe yang mirip dengan cewe yang saia maksud. Masing-masing dari mereka memiliki sebagian deskripsi yang cocok dengan data saia. Dengan asumsi bahwa cewe yang tepat ada diantara 100 cewe itu, lantas bagaimana saia menemukannya?

Nah pada kasus ini saia mencoba menggunakan jurus MCMC, yakni mengincar beberapa cewe dari total 100 cewe tersebut secara acak dan mulai dibandingkan setiap deskripsinya dengan data yang saia miliki. Pada kasus awal kemungkinannya adalah cewe-cewe tersebut memiliki kecocokan deskripsi (nilai lnL) yang rencah satu dengan lainnya, dan saia menggunakan hikmah tersebut untuk mencari yang lebih cocok deskripsinya. Pada akhirnya proses MCMC tersebut akan menyeleksi 100 cewe tersebut sampai menyisakan katakanlah 5 cewe yang sama-sama memiliki deskripsi setara (anggap saja masing-masing dari mereka memiliki 90% kecocokan deskripsi dengan data yang saia miliki).

Saia coba telaah lagi satu-per satu deskripsi mereka dan menemukan bahwa cewe yang satu memiliki kemiripan tinggi kecuali rambutnya. Cewe yang lain juga setara kemiripannya kecuali dia berkacamata, dan seterusnya. Nah dalam hal ini saia memperoleh mixing yang bagus terhadap 5 kandidat cewe tersebut. Dalam cerita rekaan ini saia buat sedikit mudah sehingga tidak perlu proses chainswap.

Nah sekarang dapat dilihat perbedaan distribusinya. Pada awalnya ketika memulai dari 100 cewe, masing-masing dari mereka memiliki peluang 1% untuk menjadi target cewe yang ingin saia pedekate. Pada kondisi ini kita mengatakan sebagai distribusi probabilitas prior = 1%. Nah berpandu dengan data, proses MCMC, dan mixing sekarang saia mendapatkan bahwa dari 100 cewe tersebut data deskripsi saia berkonvergensi ke arah 5 kandidat cewe. Itu artinya bahwa masing-masing cewe itu sekarang memiliki peluang 20% untuk menjadi kandidat yang tepat. Nah sekarang kita dapat mengatakan bahwa distribusi probabilitas posterior, yakni distribusi  probabilitas setelah berpandu pada data, adalah sebesar 20% untuk setiap cewe.

Pada akhirnya kita (termasuk saia) pun bertanya, lantas yang manakah cewe itu sebenarnya? Well, untuk itu saia hanya bisa menyerahkan jawabannya kepada masa lalu. Kita tidak pernah mengetahui kepastian mutlaknya, kita hanya mengetahui kemungkinan besarnya. Maka dari itu ijinkan saia untuk berpuas diri dengan menerima bahwa saia telah menemukan cewe tersebut, walau probabilitas bahwa itu merupakan cewe yang saia maksud.....hanyalah 20% :)

Regards,
Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Red Chop and Bayesian Inference (In Depth) Part I

Kemarin (25/5/12) saia mendapat request dari teman-teman untuk menerangkan Bayesian Inference dengan lebih mudah dimengerti. Sekedar info, Bayesian Inference merupakan sebuah algoritme rekonstruksi pohon filogenetik yang didasarkan pada uji probabilitas terhadap suatu data. Yaa saia bisa maklum karena saia sendiri juga masih dalam tahap mendalami hal tersebut sehingga masih belum dapat menerangkan dengan jelas namun mudah dimengerti.

1. Sebuah Analogi
Nah kali ini saia mendapat ide mengenai bagaimana dapat menerangkan Bayesian Inference dengan lebih mudah. Ide ini muncul tepatnya pada malam ini (26/5/12), sekitar jam 7.10 malam di Ambarukmo Plaza (ahahaha...ngiklan ni yee). Nah seperti biasanya pada malam minggu saia melakukan "ritual" di cafe Tamansari lantai 4 Amplaz, memojokan diri bersama segelas Ice Hazelnut Latte dan juga buku The Phylogenetic Handbook. Setelah selesai saia pun beranjak dari tempat duduk. Nah tidak jauh dari tempat duduk saia nampak di depan ada 2 pasangan anak kuliahan yang sedang berjalan ke arah restoran Red Chop, dan pastinya saia hanya melihat punggung mereka. Tanpa sadar saia pun melihat bagian belakang mereka agak lama dan.....saia pun berhipotesis bahwa salah satu wanita di kedua pasangan tersebut sepertinya merupakan wanita yang belum lama ini baru saia kenal dan ingin saia pedekate. Kecewa? Ya pasti larr (pake nanya)...tapi daripada saia larut dalam kekecewaan yang saia buat sendiri, saia malah mendapat ide untuk menggunakan contoh ini sebagai salah satu aplikasi Bayesian Inference.

Nah pada cerita diatas, bagaimana tepatnya saia menyimpulkan hipotesis saia tersebut, yakni itu merupakan si wanita yang saia kenal? Biar saia rumuskan, ketika saia melihat salah satu wanita di pasangan tersebut kemungkinannya hanya dua, yakni itu adalah wanita yang saia maksud atau itu bukan wanita yang saia maksud. Nah dengan demikian probabilitas untuk masing-masing pernyataan adalah 50%. Dalam Bayesian Inference tahapan ini disebut prior, yakni tahapan dengan berbagai proporsi kemungkinannya dan belum dkaitkan dengan data-data yang ada. Dengan adanya tambahan data, maka kemungkinan 50% dari masing-masing pernyataan diatas akan berubah sehingga nantinya akan memberi arahan pernyataan mana yang didukung oleh data, itulah posterior.

Data yang saia dapatkan terkait informasi mengenai wanita tersebut mencakup analisis morfologis dan psikologis. Mengenai detailnya biarlah hanya saia dan bukan kamu yang mengetahuinya..hahaha. Nah saia mencoba mencocokan data tersebut untuk melihat pernyataan mana yang didukung oleh data. Hasilnya keluar, dan data tersebut mendukung pernyataan pertama. Wanita yang saia lihat pada saat itu adalah memang dia dan dia uda punya gandengan!! SHIT!! wkwkwk..Ehem, tapi perlu saia tekankan disini bahwa dukungan yang diberikan oleh data itu adalah probabilitas. Kenyataan bahwa wanita di Amplaz itu memang dia atau bukan sekalipun didukung data tetaplah hanya memperkuat dugaan, bukan memastikan. Kenapa bukan memastikan? Yaa tentunya suatu kemustahilan bagi saia untuk kembali lagi ke tanggal 26 Mei 2012 jam 7.10 malam di Tamansari Amplaz dan kemudian memanggil untuk memastikannya bukan?? Nah itulah inti dari Bayesian Inference dalam filogenetik, memperhitungkan PROBABILITAS masa lalu.

2. The Real Case
Oke, sekarang kita kembali ke kasus sebenarnya yakni sequence molekular alias sequence DNA. Pada tulisan sebelumnya dikisahkan bahwa dengan menggunakan 10 taxa maka terdapat 2-juta kanditat pohon filogeni yang MUNGKIN. Ini tidak lagi semudah cerita diatas dimana kemungkinannya adalah 50%, dalam kasus ini kemungkinannya adalah 1/2000000 x 100% = 0,00005% per pohon. ini adalah prior. Kita akan meng-update prior ini dengan data sequence DNA seperti halnya data morfologis-psikologis yang saia gunakan untuk mendapatkan probabilitas posterior.

Mencari 1 dari 2-juta pohon tidaklah semudah memberikan dukungan terhadap 1 pernyataan dari total 2 pernyataan. Maka dari itu diperlukan proses pencarian pohon dengan metode Markov Chain Monte Carlo (MCMC) sampling. Proses pencarian ini menggunakan konsep bahwa dengan menggunakan data set sebagai panduan, maka kandidat-kandidat pohon yang prospektif akan berkonvergensi (menuju ke satu titik yang sama) satu sama lain. Dengan kata lain, sekelompok kandidat pohon yang terpilih ini akan memiliki probabilitas yang lebih tinggi untuk menjelaskan filogeni dataset yang kita miliki dibandingkan pohon-pohon lainnya.

Optimasi tentu diperlukan untuk MCMC sampling karena peta probabilitas untuk 2-juta pohon tersebut tidaklah semulus yang dikira. Bayangkan sebuah ruang berdimensi-3 dengan sumbu-X mewakili branch length, sumbu-Y mewakili topologi pohon, dan sumbu-Z mewakili model evolusi. Nah 2-juta pohon tersebut tersebar pada ruang ini dengan probabilitasnya masing-masing, membentuk bentangan seperti lansekap pegunungan lengkap dengan gunung-gunung dan lembahnya. Terkadang, proses MCMC tidak menghasilkan konvergensi satu titik seperti yang kita inginkan, beberapa berkonvergensi di gunung yang satu sedangkan beberapa berkonvergensi di gunung yang lainnya. Ini tentu saja membuat pusing. Bayangkan apabila gunung pertama berisikan pohon yang menggabungkan ikan-ikan dan gunung kedua berisikan gabungan ikan-kambing dengan probabilitas yang sama tinggi. Apabila kita tidak memiliki informasi pendukung apapun mengenai ikan dan kambing, maka kita bisa cukup yakin bahwa keduanya ini benar.

Nah maka dari itu proses MCMC juga dioptimasi dengan proses burn-in, mixing, dan swapping. Ingin tahu bagaimana optimasinya? tunggu part 2 dari tulisan ini yak ^^/

Regards,
Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Kumannya Berevolusi!!!

Hmm...saia masih mumet meramu bahan untuk serial tulisan ini, jadilah saia mencoba menggunakan bahan lain dulu untuk disisipkan. Ingat lho, menunda tulisan berarti menambah penyesalan kata Oom Anies Baswedan. Tapi saia tidak menunda, hanya menambalnya dengan tulisan lain. Oke langsung saja kita masuk ke inti cerita.

Ide penulisan ini muncul seketika ketika saia sedang menonton sebuah iklan. Sunggu iklan yang sangat menggugah ilham bukan. Iklan itu adalah iklan Li*eb*oy (kalo dibaca jadi "Lie Boy"...hahaha), sebuah iklan sabun mandi kesehatan yang mengandung blah..blah...blah... intinya kalo dipake nanti kita jadi sehat! Nah ada apa dalam iklan itu sehingga terkait dengan tulisan saia yang satu ini? Well, saia tertarik dengan salah satu pernyataan yang diucapkan oleh pemeran "dokter" disana, yakni "kuman yang sedang berevolusi". Nah apakah tepatnya maksud dari kuman yang sedang berevolusi tersebut? Apakah si dokter berhasil menekankan maksudnya dengan benar ke benak para pemirsa? Ataukah sebenarnya tidak ada maksud pemaknaan yang sedalam itu pada iklan tersebut?

Oke, mari kita jawab satu per satu. Jadi yang dimaksud dengan kuman yang sedang berevolusi adalah para kuman yang sedang berubah. Cukup semudan dan sesulit itu saja penjelasannya. Namun mari kita coba untuk melihatnya dengan lebih mendalam. Evolusi atau perubahan yang dimaksud dapat dimaknai pada berbagai tingkatan, mulai dari yang paling sederhana yakni DNA, protein, hingga ke stuktur dan fungsi dari si kuman itu sendiri. Lantas apa tujuan dari semua perubahan itu? ya jelas untuk beradaptasi dengan lingkungan yang semakin tidak bersahabat lah. Perlu kita ketahui bahwa penggunaan bahan kimia pembunuh kuman (desinfektan) ibarat pisau bermata dua, dan celakanya kita melulu hanya diperlihatkan salah satu matanya saja.

Perubahan pada kuman dan juga seluruh mahluk hidup di dunia ini terus berlangsung dan akan terus seperti itu sampai kiamat. Jadi terlalu naif rasanya apabila kita berasumsi bahwa kuman itu hanya 1 jenis dan mereka tetap. Pemberian desinfektan pada kuman tentu akan mematikannya, namun jangan lupakan bahwa perubahan itu selalu ada. Artinya adalah ada sejumlah kecil kuman yang masih bertahan atau kebal terhadap serangan desinfektan tersebut akibat suatu perubahan yang dialaminya. Lambat tetapi pasti, serangan desinfektan tersebut akan mematikan kuman yang tidak kebal sehingga memberikan keuntungan dari segi kompetisi terhadap kuman-kuman yang kebal. Hasil akhirnya sudah bisa ditebak, kuman-kuman kebal ini jumlahnya semakin meningkat dan kita secara awam menyimpulkan bahwa kuman yang dulu itu sudah berubah...sudah berevolusi.

Hal ini merupakan sisi mata pisau yang tidak disebutkan. Langkah menghadapi kuman yang telah kebal terhadap desinfektan tersebut adalah dengan mencari kandidat desinfektan baru yang ampuh menghadapi kuman-kuman kebal ini. Ketika desinfektan yang baru berhasil, perubahan pun akan senantiasa mengikuti dan siklus yang sama akan terulang lagi. Jadi, saran untuk menggunakan sabun dalam iklan tersebut untuk mencegah sakit pada anak lebih terkesan sebagai sebuah penyelesaian sementara saja. Yaaaa...daripada tidak sama sekali.

Perubahan seakan menjadi penyelamat para kuman tersebut, namun apakah tepatnya perubahan itu dan dimanakan tempat terjadinya perubahan tersebut? Kita mulai dari sebuah titik yang universal, mendasar, namun juga sangat vital. Ya apalagi kalau bukan DNA. Molekul DNA mengandung informasi untuk menghasilkan semua komponen sel pada kuman-kuman tersebut dan salah satu komponen vital pada kuman ini menjadi target dari si desinfektan. Dengan demikian, apabila komponen ini diubah maka desinfektan tidak lagi menjadi masalah. Perubahan pada skala DNA (mutasi) inilah yang menjadi awal evolusi. Mutasi DNA ini ada yang bersifat spontan dan juga ada yang bersifat adaptif. Pada akhirnya, urutan DNA yang berubah akan menyandi protein berbeda atau menghasilkan semacam kapsula pelindung yang mungkin tidak dapat dikenali oleh desinfektan, sehingga WAH...si anak menjadi sakit dan ITU KARENA KUMAN YANG SUDAH BEREVOLUSI.

Jadi, apakah si dokter berhasil menanamkan pemahaman diatas ke benak kita-kita yang menontonnya ini? Well, jawabannya saia serahkan kepada anda semua. Sedikit saran, pernyataan diatas sebaiknya diubah menjadi ITU KARENA EVOLUSI YANG TERJADI PADA SI KUMAN...hahaha

ENJOY!!

Regards,
Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: Analisis Molecular Clock

Pemetaan laju evolusi. (a) variasi pada laju evolusi (divergensi) antar spesies seiring dengan waktu; (b) Pemetaan dengan "global clock" tidak dapat mengakomodasi keseluruhan variasi; (c) Penggunaan model non-clock mengakomodasi seluruh variasi namun tidak dapat memberikan informasi waktu divergensi akibat parameter yang terlalu banyak; (d) model relaxed clock yang menjadi penengah antara global clock dengan non-clock; dan (e) model local clock yang mengakomodasi perbedaan laju evolusi antar subgrup taxa.

Terjebak dalam kamar kost di malam yang sumux sungguh membuat saia merasa ngantuk tapi gak bisa tidur. Yasuda lah daripada merenungkan hidup dan masa depan dunia, lebih baik saia lanjut menulis saja. Kali ini saia ingin berbagi cerita mengenai sebuah hipotesis dalam dunia filogeni molekular. Hipotesis tersebut dikenal sebagai Molecular Clock alias jam molekular. Nah apa maksudnya tuh? Mari kita pindah ke paragraf selanjutnya.

Jadi pada jaman dahulu kala, tepatnya tahun 1965, Oom Emile Zuckerkandl dan Linus Pauling mengemukakan bahwa laju evolusi molekular urutan protein untuk semua mahluk hidup bersifat konstan. Dengan demikian, kita dapat menghitung waktu divergensi suatu taxa hanya dengan menghitung jumlah perubahan asam amino dalam urutan proteinnya. Berdasarkan hal tersebut maka hipotesis molecular clock dapat digunakan untuk mengestimasi kapan tepatnya divergensi suatu spesies di masa lampau, persis seperti memetakan rentang umur fosil pada studi-dtudi paleontologi. Apabila ditinjau lebih dalam, hipotesis molecular clock sejalan dengan teori netral (Neutral Theory of Evolution) yang pernah dikemukakan oleh Oom Motoo Kimura pada akhir 1969. Teori netral menyatakan bahwa perubahan evolusi pada tingkat molekular adalah sepenuhnya netral dan tidak berpengaruh terhadap kelangsungan hidup (fitness) organisme. Nah netralitas dalam laju substitusi ini kemudian diperlukan untuk memastikan laju evolusi yang konstan sehingga molecular clock pun dapat dipetakan.

Hingga saat ini penerapan molecular clock dalam rekonstruksi filogenetik masih cukup kontroversial. Hal ini disebabkan adanya penelitian yang mengungkapkan bahwa berbagai spesies yang berbagi gen yang sama ternyata memiliki laju substitusi yang berbeda satu dengan lainnya. Selain itu, prediksi filogeni yang diterapkan dengan mengasumsikan molecular clock ternyata memberikan estimasi waktu divergensi spesies yang berbeda jika dibandingkan dengan data paleontologis. Dengan demikian, jelas bahwa laju evolusi antar spesies tidaklah konstan seperti yang diasumsikan oleh molecular clock.

Jadi, apakah dengan demikian kita harus membuang jauh-jauh hipotesis molecular clock ini? Em, mungkin ya mungkin juga tidak. Cara terbaik untuk menjawab ini adalah dengan sedikit memodifikasi asumsi yang ada pada hipotesis molecular clock. Pada dua paragraf sebelumnya kita membayangkan bahwa molecular clock ("global molecular clock" untuk lebih tepatnya) memberikan satuan waktu yang seragam untuk semua spesies/taxa yang diperbandingkan. Hal ini jelas terbantahkan oleh serangkaian penelitian. Terdapat gagasan bahwa kita dapat menggunakan model "relaxed molecular clock" yang bersifat mengakomodasi variasi laju evolusi antar taxa, namun masih memberikan prediksi waktu evolusi untuk setiap taxa. Selain itu, model "local clock" juga diajukan sebagai alternatif lainnya. Pada model local clock ini variasi laju evolusi pada antar taxa sebenarnya dapat dipilah menjadi kelompok-kelompok tertentu dengan laju yang mirip antar satu dengan lainnya. Pemilahan tersebut tentu saja akan sejalan dengan pembentukan clade (kelompok evolusi) karena taxa yang berkerabat dekat tentu akan memiliki laju evolusi yang mirip.

Tahapan awal analisis molecular clock untuk melihat apakah taxa yang diperbandingkan memiliki laju evolusi yang sama atau berbeda adalah dengan melakukan Likelihood Ratio Test (LRT). Perhitungan nilai LRT baru dapat dilakukan apabila pohon kita sudah diberi root (rooted). Kita dapat melakukan rooting pada pohon kita dengan cara menggunakan outgroup, yakni spesies yang berkerabat jauh dengan ingroup kita (Lihat tulisan The Root). Dalam perhitungannya, LRT akan membandingkan antara pohon unrooted dengan pohon rooted menggunakan data yang sama. Hipotesis awalnya (H0) adalah nilai likelihood antar keduanya tidak berbeda dari nol secara signifikan. Apabila secara signifikan berbeda dari nol (H0 ditolak, H1 diterima), artinya terdapat perbedaan laju evolusi antar taxa di dalam ingroup. Nah apabila kemungkinan kedua yang terjadi maka kita harus mulai berpikir untuk menggunakan model "relaxed clock" atau "local clock".

Hmm...sebenarnya masih ada beberapa cakupan terkait molecular clock, namun saia sendiri masih kesulita untuk memahaminya (apalagi menjelaskannya). Jadi untuk tulisan ini saia cukupkan sampai disini dulu. Kalau sudah paham, baru saia lanjutkan lagi pada tulisan berikutnya ^^/

Regards,
Victor Apriel

Sebuah Tulisan Evolusi dan Filogeni: The Root

The root yang diposisikan pada pangkal pohon

Em sebenarnya sih saia mau memberi judul "akar" untuk tulisan ini, tapi takut nanti disangka menjiplak judul novelnya Mba Dewi Lestari. Oke jadi sebenarnya apakah yang dimaksud dengan "The Root" dan juga proses "Rooting" dalam filogeni?

Baiklah, lagi-lagi kita akan memulai tulisan ini dengan sebuah definisi. "The root" merupakan sebuah titik/nodus yang menghubungkan semua OTU/taxa/organisme yang diperbandingkan dalam pohon filogenetik. Nah titik ini diperkirakan sebagai organisme/taxon leluhur (ancestor) dari semua taxa pada pohon tersebut. Kemudian "rooting" merupakan proses untuk mengidentifikasi posisi root pada pohon. Nah tujuan utama proses rooting adalah untuk melihat bagaimana proses evolusi, atau tepatnya divergensi, berlangsung dari satu organisme ke organisme lainnya. Idealnya, root harus memenuhi kaidah "mid-point criterion", yakni ditempatkan pada pertengahan internal branch terpanjang dalam pohon filogeni.

Lantas bagaimana caranya rooting? Proses rooting dapat dilakukan dengan penambahan "outgroup" pada data yang pohonnya ingin kita rekonstruksi. Outgroup merupakan satu atau sekelompok organisme/taxa yang berkerabat jauh dengan taxa ingroup kita. Lalu bagaimana kita tahu suatu outgroup itu berkerabat dekat/jauh padahal pohonnya saja belum kita rekonstruksi. Nah pada titik inilah kita diuji bagaimana memilih outgroup yang tepat. Pemilihan outgroup untuk organisme yang memiliki catatan fosil relatif mudah untuk dilakukan. Cari saja organisme dengan homologi terbanyak yang tersingkap pada lapisan bumi yang lebih tua dari ingroup kita. Dengan begitu kita bisa yakin bahwa organisme tersebut beumur lebih tua dari semua ingroup kita. Namun bagaimana dengan kasus dimana tidak ada catatan fosil mengenai ingroup maupun outgroup? Nah pada umumnya adalah kita membandingkan beberapa outgroup dengan ingroup yang kita miliki, kemudian kita coba merekonstruksi pohon UPGMA dan membandingkan semuanya. Outgroup yang posisinya paling dekat dari ingroup terjauh merupakan kandidat yang cocok untuk dijadikan outgroup pada rekonstruksi yang kita inginkan.

Ada satu hal yang perlu kita ingat dalam penggunaan outgroup dalam proses rooting, yakni sebuah asumsi yang cukup mendasar. Proses rooting dilakukan dengan menggunakan asumsi bahwa laju substitusi antar taxa adalah sama. Dengan demikian, waktu divergensi (time of divergence; TOD) bersifat konstan dseiring dengan jumlah substitusi yang ada pada setiap taxon. Nah waktu divergensi dapat dihitung berdasarkan branch length pada pohon, yang kemudian nilai branch length itu merupakan interpretasi dari jumlah substitusi pada urutan DNA/asam amino suatu taxa. Pada kenyataannya, beberapa penelitian membuktikan bahwa laju tersebut tidaklah sama antar spesies dan bahkan juga tidak sama antar gen. Hal ini disebabkan karena proses substitusi suatu karakter (nukleotida/asam amino) tidaklah netral seperti yang diajukan dalam Neutral Theory of Evolution oleh Oom Motto Kimura. Selain faktor netralitas, adanya faktor adaptasi organisme, efek bottleneck, dan lainnya turut berkontribusi dalam perubahan laju substitusi pada DNA dan proteinnya.

Hmm..sepertinya sekian dulu mengenai rooting. Saia juga baru saja mendapatkan artikel mengenai metode baru untuk proses rooting yang bisa dibaca di link ini: http://www.simmap.com/bollback/jpb_pdf/Huelsenbeck2002.pdf. Akhir kata saia tutup tulisan ini dengan......selamat membaca saja deh.

Regards,
Victor Apriel